由枯草芽孢桿菌（納豆）發酵的木豆，其抗氧化，血管緊張素轉化酶抑制活性，納豆激酶和抗高血壓特性探討

英文文獻出處：J Food Drug Anal . 2015 Dec;23(4):750-757.

摘要

由於亞洲國家心血管疾病的高發，人們越來越多地研究了來自亞洲的傳統發酵食品的抗動脈粥樣硬化作用。這項研究調查了枯草芽孢桿菌發酵在木豆中產生的納豆激酶（一種絲氨酸纖溶酶）。枯草芽孢桿菌14714，枯草芽孢桿菌14715，枯草芽孢桿菌14716和枯草芽孢桿菌14718用於產生納豆激酶。使用枯草芽孢桿菌14715發酵32小時可獲得木豆中最高的納豆激酶活性。此外，與未發酵的豌豆相比，枯草芽孢桿菌14715發酵的木豆中的抗氧化劑（酚類和類黃酮）水平和血管緊張素轉化酶抑制活性增加。在動物模型中，我們發現木豆的水提取物（100 mg / kg體重）和枯草芽孢桿菌發酵的木豆的水提取物（100 mg / kg體重）均顯著改善了收縮壓（21 mmHg）和自發性高血壓大鼠的舒張壓（30 mmHg）。這些結果表明，芽孢桿菌發酵的木豆有益於心血管健康，可以作為預防高血壓的新型膳食補充劑或功能性食品而開發。

引言

動脈粥樣硬化是冠狀動脈疾病的基礎，也是人類最嚴重的心血管疾病（CVD）之一。這種疾病的特徵是慢性血管損傷導致血栓栓塞[1]。因此，在預防動脈粥樣硬化和由此產生的血栓性疾病方面已經付出了巨大的努力[2]。近年來，許多研究已經分析了飲食習慣對動脈粥樣硬化的產生和緩解的影響[1]。由於亞洲國家CVD的發病率較低，因此亞洲的傳統發酵食品已成為醫學研究的主題[3]。因此，已經有人提出，包括水果，蔬菜和穀物在內的發酵和醃製食品，可能有益於礦物質，維生素，膳食纖維，低聚醣，植物甾醇和抗氧化劑等營養成分[4]。

在食品發酵過程中，通過微生物或酶的活性帶來了所需的生化變化以及風味和質地的顯著改變。例如，納豆提取物（一種由枯草芽孢桿菌發酵熟大豆發酵制得的傳統食品）已知由納豆激酶（一種絲氨酸纖維蛋白水解酶）組成，這種酶是從營養枯草芽孢桿菌細胞中分泌出來的，具有很強的纖維蛋白分解活性[5。 ]。納豆激酶的體內抗凝活性通過溶解纖維蛋白和可溶性纖維蛋白單體來增強血液循環。由於該激酶減少了血液凝結，因此有助於預防CVD [6]。最近的研究表明，納豆的許多成分可用於預防CVD和高血壓[7]。

木豆（Cajanus cajan L.）是熱帶和亞熱帶雨林農業的重要穀物豆類作物。木豆是一種富含植物甾醇的食品，已被證明具有抗血脂異常的作用[8]。儘管紅克用於人類營養的利用可能受到蛋白酶抑製劑的限制[9]，但木豆提取物通常用於治療糖尿病，發熱，痢疾，肝炎，麻疹，鐮狀細胞性貧血和肝病世界[10]，[11]。最近，我們發現木豆可以減輕RAW264.7巨噬細胞的炎症並避免其氧化損傷[12]。這項研究的目的是調查納豆激酶的降壓特性，血管緊張素轉化酶抑制（ACEI）活性以及枯草芽孢桿菌發酵的木豆的抗氧化活性。

方法

2.1。細菌菌株和木豆發酵

木豆是由台灣農業委員會台東區農業研究與推廣站提供的。枯草芽孢桿菌14714，枯草芽孢桿菌14715，枯草芽孢桿菌14716和枯草芽孢桿菌14718的菌株購自台灣新竹市生物資源收集和研究中心。將菌株在營養肉湯中培養[6]，並在37°C下孵育24小時。然後將每種活化的培養物接種到10mL營養肉湯中，並在37℃下孵育16小時。隨後將培養物稀釋至108-109個菌落形成單位/ mL，並用於接種蒸熟的木豆進行發酵。簡要地，將25克木豆洗滌並在蒸餾水中浸泡18小時。倒出水後，將木豆放在架子上，並在121°C下蒸30分鐘。將蒸過的木豆冷卻，並接種細菌接種物（2％），並在各種溫度（30°C，35°C，37°C，40°C和45°C）和各種相對濕度（75％）下孵育分別在8小時，16小時，24小時，32小時，40小時和48小時），80％，85％，90％和95％）中評估納豆激酶和ACEI生產的最佳條件。在發酵結束時，將所有樣品冷凍乾燥（Alpha 1-2 / LD-2冷凍乾燥器，RZ-5真空泵，Christ，德國哈茨Osterode）。隨後，用蒸餾水（1：10 / v：v）提取枯草芽孢桿菌發酵的木豆粉末，並將提取物冷凍乾燥並在-20℃下保存。

2.2。枯草芽孢桿菌木豆ACEI活性的測定

將45μL枯草芽孢桿菌發酵的木豆提取物樣品加到預先溶解在0.1M硼酸鈉緩衝液（pH 8.3）中的45μLACE（終濃度：33 mU / mL）中，使混合物反應在37°C下放置10分鐘。隨後，加入45μL的3mM N-巰基-1-組氨酸-1-亮氨酸水合物，並在37℃下孵育30分鐘，並用150μL的0.1N鹽酸終止該反應。使用高效液相色譜儀（PU2089 plus，Jasco Co.，東京，日本）分析二十微升反應溶液。色譜分離在C18色譜柱（25 cm×4.6 mm內徑，5μm，Discovery Bellefonte，PA，美國）上進行。乙腈/水（0：100–70：30，含0.05％三氟乙酸）溶液用作流動相，流速為1 mL / min。使用紫外線檢測器（UV2075 plus，Jasco Co.）將ACEI活性與馬尿酸合成進行了比較[13]。

2.3。 納豆激酶活性測定

納豆激酶活性由Japan Bio Science Laboratory Co.（1997）[14]測定。 簡而言之，將1.4 mL 50mM KCl-H3BO3緩衝液和0.4 mL 0.72％的纖維蛋白原在37°C下孵育5分鐘，然後添加0.1 mL凝血酶（20 U / mL）在37°C下反應10分鐘。 C。 隨後，加入0.1mL枯草芽孢桿菌發酵的木豆提取物，並在37℃下溫育60分鐘。 離心5分鐘（12,000rpm）後，用2mL的0.2M三氯乙酸酯終止反應。 在275nm處測量吸收值。 納豆激酶的活性用下式計算：

Nattokinase Activity = ( AB - AS ) /0.01*1/60*1/0.1*D

其中AB =空白的吸收值； AS =樣品的吸收值； D ＝樣品稀釋。

2.4。 2,2-二苯基-1-吡啶並肼基清除活性的測定

使用所述方法測量[2,2-二苯基-1-吡啶並肼基（DPPH）]的自由基清除活性。簡而言之，將枯草芽孢桿菌發酵的木豆提取物和DPPH甲醇溶液混合，並在黑暗中放置60分鐘。測量反應混合物在517nm的吸光度。

2.5。降低功率的測定

還原力是使用Duh和Yen [16]的方法測量的。將枯草芽孢桿菌發酵的木豆提取物，磷酸鹽緩衝液和六氰合鐵酸鉀溶液混合併在50°C加熱20分鐘，然後加入三氯乙酸。在3000g離心10分鐘後，將上清液與蒸餾水和氯化鐵混合，然後將反應保持10分鐘。測量在700nm的吸光度。

2.6。總抗氧化劑活性測定

使用Miller和Rice-Evans [17]的方法測量了枯草芽孢桿菌發酵的木豆提取物的抗氧化能力。將過氧化物酶，過氧化氫，2'-氮雜雙[3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽（ABTS）和蒸餾水混合，並在黑暗中於25°C儲存1小時。隨後添加樣品並確定在734nm的吸光度。

2.7。總酚酸，類黃酮和花色苷的含量測定

類黃酮含量根據改良方法測定[18]。將樣品與水，硝酸鋁和CH3COOH混合。將混合物在暗室中放置40分鐘，並使用分光光度計在415nm下針對空白測量吸光度。將槲皮素用作標準校準曲線，並使用基於校準曲線的線性方程式計算樣品中的類黃酮含量。使用Singleton和Rossi [19]修改過的方法估算酚類化合物，沒食子酸作為標準酚類化合物。簡而言之，將樣品與Folin和Ciocalteu的酚試劑混合，並添加碳酸鈉溶液（7.5％），放置90分鐘。在760nm處測量吸光度。結果表示為毫克沒食子酸當量/克提取物。總花色苷含量是使用pH差示法測量的[20]。

2.8。動物實驗和實驗時間表

將雄性自發性高血壓大鼠（SHRs，5週齡； BioLASCO，台灣有限公司，台灣宜蘭）關在單獨的塑料籠中，並在25±2的相對濕度下進行12小時的明暗循環，相對濕度為60％ ℃。使動物自由攝取常規的囓齒動物食物和水1週，以適應新的環境。實驗是在我們研究所動物中心的合格動物繁殖室內進行的（協議符合《動物保護法》（2001年1月17日修訂的《動物保護法》中所述的準則）， 9000007530，台灣行政院農業委員會，中華民國）。這項動物研究得到了國立嘉義大學機構動物護理和使用委員會的批准。將動物隨機分為四組（n = 6），包括：（a）高血壓SHR； （b）木豆的SHRs +水提取物[100 mg / kg體重（bw）]； （c）SHRs +枯草芽孢桿菌發酵的木豆水提取物（100 mg / kg體重）； （d）SHRs +卡托普利（5 mg / kg體重），一種ACE抑製劑。將所有樣品口服給予SHR 8週。連續8週每2週測量一次SHR的血壓。

2.9。血壓測量

在新環境中適應1週後，在單次口服樣品後0小時，4小時，8小時和24小時，將每隻大鼠輕輕置於37±1°C的恆溫容器中，使用帶個人計算機控制的光電系統（Visitech BP-2000，Napa Place，NC，美國），通過尾袖體積描記術測量收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）。計算使用至少五個連續讀數的平均值。在長期給藥期間，在每週給藥樣品之前測量SBP和DBP。

2.10。統計分析

數據表示為平均值±標準偏差。使用SPSS 17.0版的一般線性模型程序（SPSS Institute，Inc.，芝加哥，伊利諾伊州，美國）使用方差的單向分析確定統計顯著性，然後使用Duncan檢驗對方差進行單向分析。

結果和討論

3.1。 納豆激酶活性研究

我們在這裡表明，枯草芽孢桿菌發酵木豆會導致納豆激酶的產生增加，這已顯示出對血栓形成具有治療作用。 如圖1所示，在各種枯草芽孢桿菌菌株發酵過程中發現了納豆激酶的產生，包括枯草芽孢桿菌14714，枯草芽孢桿菌14715，枯草芽孢桿菌14716和枯草芽孢桿菌14718。 由枯草芽孢桿菌14715發酵24小時至48小時（圖1A）。 對於此枯草芽孢桿菌菌株，最佳發酵溫度為35°C持續32小時（圖1B）。 發酵32小時後，接種107個菌落形成單位/ mL枯草芽孢桿菌14715可獲得最高的納豆激酶活性（48.80纖溶單位/ g）（圖1C）。 90％的最佳相對濕度在枯草芽孢桿菌14715發酵32小時後產生的納豆激酶活性為53.03纖溶單位/ g（圖1D）。

3.2。 枯草芽孢桿菌發酵的木豆水提取物的ACEI活性

血管緊張素刺激腎素-血管緊張素系統中醛固酮的釋放。 它會增加鈉和水的重吸收，導致血管收縮，並增加血壓。 它的非活性前體血管緊張素原被腎素轉化為非活性血管緊張素I，而ACE被轉化為血管緊張素II。 牛奶被廣泛認為是乳酸菌產生ACE抑制肽的底物。 許多ACE抑制肽已被證明可有效降低SHR的血壓[21]。 在這項研究中，我們發現木豆的枯草芽孢桿菌14715發酵在32小時內產生了顯著的ACEI活性，EC50為1.47 mg / mL（圖2）。 然而，在未發酵的木豆中沒有發現這種作用（數據未顯示）。

EC50 = 一種激動劑產生 50% 最大效應的莫爾濃度

3.3。枯草芽孢桿菌發酵的木豆水提取物的體外抗氧化活性

氧化損傷介導了動脈粥樣硬化的發病機理，這是全世界CVD的主要促成因素。脂質過氧化物對膽固醇酯酶的活性具有抑製作用，膽固醇酯酶是在動脈粥樣硬化期間負責斑塊形成的酶。先前的研究表明，對飲食進行修改以包括含抗氧化劑的食物可能會預防或改善CVD [22]。氧化應激在高血壓的發病機理中的作用已有數項研究報導，並且提出的主要機制是一氧化氮的生物利用度降低，從而促進了內皮功能障礙[23]。據報導，高血壓患者脂質過氧化副產物升高，抗氧化系統活性降低[23]。幾項研究表明高血壓中O2-的水平增加，並暗示煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是這種過量O2-的來源[24]。

接下來，我們研究了來自枯草芽孢桿菌14715發酵木豆的水提取物的抗氧化活性。與未發酵的豌豆相比，枯草芽孢桿菌14715發酵的木豆的DPPH清除活性，總抗氧化活性（與trolox相當的抗氧化能力）和還原能力呈劑量依賴性（圖3）。

3.4。 枯草芽孢桿菌發酵的木豆水提取物的抗氧化劑

與未發酵的木豆相比，枯草芽孢桿菌14715發酵32小時可顯著提高總酚類化合物（15.1 mg / g水提取物）和類黃酮（5.39 mg / g水提取物）的水平，而花色苷水平卻降低了（ 10.8 mg / g的酚類化合物，2.4 mg / g的木豆水提取物（表1）。 這些結果表明，通過枯草芽孢桿菌14715發酵將木豆中的花色苷轉化為類黃酮。

我們不僅發現枯草芽孢桿菌14715發酵的木豆水提取物中的納豆激酶活性增加，而且抗氧化能力和ACEI活性也增加。 這些發現表明，枯草芽孢桿菌發酵的木豆提取物除了具有抗動脈粥樣硬化的潛力外，還具有抗高血壓的潛力，並且這些結果與納豆提取物相似[25]。

3.5。枯草芽孢桿菌發酵的木豆水提取物的降壓活性

越來越多的證據表明，氧化應激的增加與代謝綜合徵中CVD的發病機理有關。自由基產生與細胞抗氧化劑系統能力之間不平衡可能導致氧化應激，誘導細胞損傷和脂肪細胞因子生成失調，從而導致與肥胖相關的胰島素抵抗和高血壓[26]。

據報導，富含多酚的食物在體外通過ACEI活性表現出抗高血壓作用[27]。抗氧化劑還可以改善SHR中腸系膜動脈的內皮依賴性血管舒張[26]。目前，我們發現與未發酵的木豆提取物相比，用枯草芽孢桿菌14715發酵木豆會增加納豆激酶活性，並增加抗氧化劑水平（酚類和類黃酮）和ACEI活性。在我們的體內模型中，數據顯示，枯草芽孢桿菌發酵的木豆的水提取物（100 mg / kg體重）分別在分別施用21 mmHg和30 mmHg 8小時後顯著減弱了SBP和DBP。這種效果比在SBP和DBP中給予木豆水提取物（100 mg / kg體重）分別高9 mmHg和17 mmHg。卡托普利施用的SHRs的SBP和DBP分別降低了29 mmHg和36 mmHg（圖4）。

此外，圖5顯示了整個給藥期間（0-8週）的平均靜息SBP和DSP的變化。 在第8週，用枯草芽孢桿菌發酵的豌豆處理過的SHRs的水提取物中的SBP和DBP分別為167 mmHg和142 mmHg，但是，在豌豆豌豆的水提取物中，SBP和DBP分別為183 mmHg和166 mmHg。 。 這些發現表明，枯草芽孢桿菌發酵的木豆的ACEI活性，納豆激酶和抗氧化活性能夠降低SBP和DBP，從而發揮抗高血壓的潛力，表明枯草芽孢桿菌發酵的木豆對心血管健康有益。

據報導，諸如白藜蘆醇（30 mg / kg bw）等植物化學物質可減輕氧化應激誘導的高血壓[28]。最近的研究報導，牛奶或乳酸菌發酵產品的ACEI肽可減輕高血壓[29]，[30]。紅麴霉發酵產品還被證明可以改善SHRs的高血壓，並改變ACEI肽的產生[31]。

炎症可能有助於加速血管損傷和高血壓，並激活腎素-血管緊張素系統[32]。木豆具有抗炎作用，可能有助於抑制血管炎症和內皮壁中的促炎分子，例如血管細胞粘附分子-1，細胞間粘附分子和E-選擇素，這些分子可能導致高血壓[ 32]。在最近的研究中，我們發現木豆能抑制炎症[12]。目前，我們的結果還表明，木豆可以預防SHRs中ACEI活性，納豆激酶和抗氧化作用的介導的高血壓。

4。結論

在這項研究中，研究了枯草芽孢桿菌發酵的木豆提取物對ACEI活性，抗氧化劑水平和納豆激酶生成的有益作用。 枯草芽孢桿菌發酵的木豆提取物顯著提高了抗氧化劑水平，並提高了納豆激酶和ACEI活性。 這些結果表明，枯草芽孢桿菌發酵的木豆可能有益於心血管健康，並有可能被開發為新的膳食補充劑或以具有預防疾病特性的功能性食品銷售。