景天樹（山楂）的果實可改善β澱粉樣蛋白的記憶力減退蛋白誘導的阿爾茨海默氏病小鼠模型

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景天果（山楂）的果實改善了β-澱粉樣蛋白誘導的阿爾茨海默氏病小鼠模型中的記憶缺陷.

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摘要

民族藥理學相關性：景天樹的果實是東亞地區廣泛用作消化藥物的傳統藥物。 儘管中草藥將其用於心理健康，但尚無科學證據。

研究目的：這項研究的目的是顯示山楂（Cretaegus pinnatifida）（CPE）果實的乙醇提取物對阿爾茨海默氏病模型小鼠具有神經保護作用。

材料和方法：腦室內注射Aβ可誘發阿爾茨海默氏病樣病理。 被動迴避和Y迷宮任務用於檢查CPE對Aβ記憶障礙的影響。 免疫組織化學用於檢查CPE對神經膠質活化的作用。 ThT法用於觀察CPE對Aβ聚集的影響。 使用MTT和LDH釋放測定來檢查CPE對Aβ誘導的細胞毒性的作用。

結果：CPE預防了Aβ誘導的記憶障礙模型中的記憶缺陷。 此外，CPE阻止了注射Aβ的模型海馬中的神經膠質細胞激活。 在體外測試中，CPE以各種不同濃度梯度的方式抑制Aβ纖維的形成。 CPE還引起Aβ原纖維的分解。 與此同時，CPE阻斷了由Aβ誘導的神經元細胞死亡。

前言

傳統上，Cretaegus pinnatifida Bunge（山楂`；景天果）的果實被用作消化援助（Dharmananda，2004年）。中草藥書籍（草藥；成千上萬的中草藥配方）還表明，景天果對精神健康有調節作用（Blumenthal等，2000;黃和王（1993）。最近的研究表明，水果山楂屬植物具有神經保護特性（Chang et al，2013年），抗動脈粥樣硬化作用（Zhang等人，2013年）和調節脂質代謝（Niu et al，2011）。先前的研究表明從裙帶菜種子中分離出的化學物質可防止Aβ聚集（Guo等人，2018; Huang等人，2018）。而且，山楂的種子改善了CT105細胞所被誘導的細胞阿爾茨海默氏病模型的炎症反應和膽鹼能（cholinergic）功能障礙所致的健忘症模型的記憶障礙（Jung等，2002；Wang et al。，2009）。

但是，山楂果的果實是否可以改善AD小鼠模型中的記憶缺陷尚不清楚。

阿爾茨海默氏病（AD）是主要的神經退行性疾病之一疾病。 AD患者表現出各種神經系統的認知缺陷症狀，導致影響日常生活的殘疾。 儘管乙酰膽鹼酯酶抑製劑可以有效地延遲AD和改善認知功能，它具有許多副作用，包括在失眠症中的表現（Dunn等，2000； Hashimoto等，2000）。 因此，更安全治療AD需要更有效的疾病緩解藥物。

澱粉樣蛋白β（Aβ）被認為是AD的主要成分。蛋白水解澱粉樣前體蛋白的切割產生Aβ。單體Aβ為無毒，很容易從大腦中清除。

但是，寡聚Aβ是可溶性聚集形式的Aβ，具有使神經突觸接受體、通道無觸發功能的毒性。

（Renner et al，2010; Shankar et al，2007）（Arispe等，1996）（Jo等，2011）。已發現Aβ的原纖維可誘導神經炎症，導致神經元細胞損傷（Sondag等，2009； White等，2009）。

2005年）。因此，可以阻止Aβ聚集或阻止聚集Aβ聚集體的藥物可能是AD疾病改變的良好藥劑。

在這裡，我們測試了山楂果提取物（CPE）的乙醇提取物對Aβ誘導的記憶障礙模型的影響。

材料與方法

動物

ICR小鼠（雄性，6週齡）獲自Daehan Biolink（Choongbook，韓國）。 將小鼠存放在指定的動物中護理室。 房間的溫度為23±2°C。 燈光週期為保持間隔為12小時。 濕度為50±10％。 食物和隨意提供水。 小鼠被關在動物房裡適應一周。 所有動物實驗均獲得IACUC的批准韓國大邱Haany大學（DHU2016-057）。

CPE準備

購買了山楂（Cretaegus pinnatifida Bunge）（薔薇科）的果實來自Okchundang Corp.（韓國慶北永川）。 這將Pinusatifida Bunge的果實研磨並加熱在60°C水中的60％乙醇洗滌2小時，以獲得提取物。 提取物是收集，並使用旋轉真空蒸發儀（Eyela，日本），冷凍，凍乾並在−20°C下保存，直至進一步使用（產率； 5％）。

由於以前的報告表明chlorogenic acid和hyperoside在AD模型中具有神經保護作用，因此我們選擇它們是為了CPE的標準化（Liu等人，2018; Oboh等人，2013）。

Chlorogenic acid 或 hyperoside先用甲醇溶解。過濾後（0.2μm膜過濾器），超高效液相色譜（UPLC）系統（ACQUITY UPLC系統，沃特世，美國）分析樣本。

在ACQUITY UPLCC BEH上於35°C進行分離

C18色譜柱（2.1×100 mm，1.7μm）三氟乙酸（0.1％）在

乙腈中的水和三氟乙酸（0.1％）分別用作流動相A和B。如表1所示，使用了梯度洗脫程序。流動相流速為0.3 ml /紫外檢測波長為254 nm。在摘錄中，檢出0.185％的綠原酸和0.105％的高絲皂苷（補充圖1）。憑證標本由吉旭榮教授，存放在大邱植物標本室漢尼大學（No.804327）。

CPE給藥和Aβ注射

用CPE（3和30 mg / kg，口服）或薑黃素治療小鼠（注射量，30 mg / kg，口服），作為陽性對照，從注射Aβ前1天到行為測試結束（圖1A）。 Aβ購自Anaspec（英國Chambridge）。 Aβ以1 mg / ml的濃度溶於DPBS中，在37°C下攪拌24小時以聚集。 小鼠麻醉使用異氟烷（2％異氟醚誘導和1.5％的維持率使用蒸發器在O2中添加異氟烷）。 手動將Aβ（5μl）注入左心室。

被動迴避任務

我們使用梭箱進行了被動迴避測試，這是由分開的黑暗和照明房間組成。 房間之間有扭索尖齒的門。 在一項訓練試驗中，將小鼠置於照明的房間，然後斷頭台門在10秒鐘後打開。 什麼時候鼠標從斷頭台進入黑暗的房間關閉並通過電網傳送電擊（0.5 mA，持續3 s）地板（培訓試用）。 第二天，將老鼠重新引入照明的房間。 進入暗室的逐步延遲是測量300秒（測試）。

Y迷宮任務

Y型迷宮由黑色塑料製成，由三個黑色走廊組成（角度120°，40×5×15 cm）。 將小鼠放在一隻跑道上並監測跑道入口的模式，持續8分鐘。 如果老鼠因緊張連續進入三個跑道，我們予此實際行為改變，給予得分1點。 我們使用以下公式來測量自發性行為狀態改變，自發性行為變更交替狀態（％）=實際行為交替變更得分/（總計跑道入口數– 2）x 100

組織製備和免疫組織化學

麻醉小鼠（Zoletil50®，10 mg / kg，即刻）使用100 mM磷酸鹽緩衝液（PB，pH 7.4）經心動。 每次融合後，將小鼠用冰冷的4％多聚甲醛固定通過經心灌注。 分離大腦並在4％PFA（50 mM，pH 7.4，PB）過夜固定。 大腦在30％蔗糖中持續加溫（在50 mM磷酸鹽緩衝液中，切片前在4°C的PBS）溶液中。 冠狀腦切片（30μm）用低溫恆溫器製成，然後將其儲存在溶液中（30％甘油，30％乙二醇和40％DW）在4°C下進行。

一抗包括大鼠抗Iba-1和山羊抗GFAP抗體（1：1000）與0.3％Triton X-100和1.5％正常血清。將腦切片泡於一抗溶液中24小時。清洗後，對切片進行處理，分別用生物素化的二抗（1：1000）處理90分鐘，然後用avidin-過氧化物酶複合物（1：100）處理1 小時。洗滌後，切片用0.02％3，3'-二氨基聯苯胺和0.01％H2O2處理約3分鐘。這些切片封片於預先塗抹過gelatin的載玻片上。使用由低到高濃度的酒精脫水，使用xylene清洗。將細胞（hilus）使用5個sections進行定量（從bregma往後算-1.50 mm處，分為10個section）。

Aβ聚集測定

為了製備硫代黃素T（ThT）儲備溶液，將ThT（8 mg）溶於10 ml PBS（10 mM磷酸鹽，150 mM NaCl，pH 7.0）中，用0.2μm注射器過濾器過濾。 將原液稀釋於PB（50毫升緩衝液中的1毫升ThT儲備液）用於工作溶液。 樣本（藥物+Aβ單體或原纖維，200μl）與ThT孵育於黑色μClear96微孔板中的37°C。 在指示的時間點（0、0.5、1,3、6、9、12和24小時進行抗聚集研究； 0、1、3、6、9、12和24小時進行去聚集研究）記錄每個樣品的ThT熒光強度。使用FLUOstar OPTIMA讀板儀（BMGLabtechnologies，Melbourne，VIC，Australia）具有激發/發射濾光片設置為440/490 nm。

神經母細胞瘤Neuro2a細胞（ATCC，弗吉尼亞州，美國）在Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM；大邱市WelGENE公司，韓國），其中含10％的胎牛血清（大邱WelGENE公司，

韓國）和1％青黴素/鏈黴素抗生素（WelGENE Co.，韓國大邱市），並在37°C的5％CO2加濕培養箱中生長。補充了1-2％FBS的DMEM用於分化。 將細胞與Aβ（10μM）處理24小時。

MTT測定法和LDH釋放測定法

將細胞鋪在96孔板中。 然後更換培養液用含有1 mg / ml MTT的新鮮培養基。 在37°C下放置4小時，將孔內容液抽出，將染料溶解在DMSO中並在595nm處測量吸光度。 乳酸脫氫酶（LDH）釋放使用LDH細胞毒性檢測試劑盒進行測量（羅氏，魁北克，加拿大）根據製造商的說明。

結果

CPE預防了Aβ引起的記憶障礙

CPE減少了Aβ誘導的海馬神經膠質細胞激活

CPE阻止Aβ聚集

CPE阻斷了Aβ誘導的神經元細胞死亡

討論

在本研究中，我們以不同濃度探討出CPE預防了Aβ纖維誘導的記憶障礙。Aβ誘導海馬小膠質細胞和星形膠質細胞數量增加CPE也明顯減少了齒狀回區域。 CPE阻止了Aβ聚集和Aβ原纖維解聚。 CPE也可以防止Aβ細胞毒性。

Aβ通過多種機制具有神經毒性。單聚體形式Aβ（二聚體和三聚體）具有直接的神經毒性作用在膜受體（Dinamarca等人，2012）、通道（Anekonda）和Quinn，2011），以及細胞內信號分子（Chauhan等，1991； Hernandez等，2010）。

Aβ的原纖維形式具有不同的作用來自Aβ的寡聚形式。 Aβ原纖維刺激神經炎症通過神經膠質細胞激活（Sondag等，2009； White等，2005），導致神經元受損（Busciglio等，1995； ana和Pahan，2004）。

但是，Aβ單體對神經元沒有有害作用系統。

這些研究表明，如果Aβ可以攻擊神經元系統，則應將其聚集。因此，預防Aβ聚集的藥物可能是AD治療發展的良好候選者。在本研究中，我們發現CPE可以以濃度依賴的方式阻止Aβ聚集。此外，CPE降解的Aβ原纖維已經形成。此外，將Aβ與CPE共同處理未能誘導神經元細胞死亡，這可能是由於CPE對Aβ聚集的阻斷作用所致。這些結果表明，CPE可能是AD療法藥物開發的候選者。

Aβ原纖維激活大腦中的神經膠質細胞（Sondag等，2009；白等人，2005），其刺激神經發炎。據報導小膠質細胞在AD的突觸功能障礙和記憶缺陷中起關鍵作用。 Aβ原纖維激活小膠質細胞並誘導炎性細胞因子IL-6，IL-1β和TNF-α的釋放（Hickman等，2008），它可以損害神經元並促進AD進程（Hanisch和Kettenmann，2007年； Hickman等人，2008年）。活化的星形膠質細胞也可能是AD腦中Aβ的重要來源（Zhao等，2011）。此外，活化的星形膠質細胞分泌多種炎症性細胞因子，包括TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8和IL-10（Qin和Benveniste，2012年）。 Aβ刺激星形膠質細胞釋放谷氨酸，從而誘導突觸外N-甲基-d-天冬氨酸受體活化，導致突觸喪失（Talantova等人，2013）。在本研究中，我們發現i.c.v.注射Aβ原纖維會導致記憶障礙，海馬中的小膠質細胞和星形膠質細胞數量也會增加。此外，CPE阻止了神經膠質細胞的增加。這種效果可能是由於CPE對Aβ原纖維的分解作用所致。否則，因為據報導CPE具有直接的抗炎作用（Kao等，2005； Shin等，2012），所以推測可能是CPE可以直接減輕由Aβ原纖維引起的神經炎症。為了澄清這一點，將需要進一步的研究。

最近的研究表明通過免疫清除Aβ 未能停止或延遲AD進展（van Dyck，2018）。 許多科學家認為，這是因為Aβ在大腦中的蓄積通常始於AD發作前大約10年（Bateman等，2012； Jack等，2010）。 因此，與找到治愈方法相比，預防Aβ聚集的藥物對於建立AD預防方法至關重要。 CPE作為一種傳統藥物，長期以來一直用於治療各種疾病。 因此，CPE也可能是發展AD治療的候選藥物。