藻藍蛋白對非小細胞肺癌細胞的體外抗腫瘤活性
- 凱莉
- May 5, 2021
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目前癌症治療仍以手術、放射線、化療為主，此文章為腫瘤細胞株實驗，僅供參考。
摘要
藻藍蛋白（Phycocyanin）是一種功能性食品著色劑，具有強大的抗癌性能。非小細胞肺癌（NSCLC）是最積極的癌症形式之一，幾乎沒有有效的治療選擇。先前的研究表明藻藍蛋白對NSCLC A549細胞具有生長抑製作用。但是，其生物學功能和對其他細胞的潛在調控機制仍然未知。在這裡，我們首次研究了藻藍蛋白在三種典型的NSCLC細胞系NCI-H1299，NCI-H460和LTEP-A2上的體外功能。結果表明，藻藍蛋白可通過調控多個關鍵基因顯著誘導NSCLC細胞凋亡，細胞週期停滯以及抑制細胞遷移，增殖和集落形成能力。令人驚訝的是，發現藻藍蛋白通過調節NSCLC細胞的NF-κB信號傳導來影響細胞表型。我們的發現證明了藻藍蛋白的抗腫瘤功能，並為調節NSCLC細胞中藻藍蛋白提供了有價值的信息。
前言
廣泛的研究表明，許多源自食物和食品補充劑的天然產品具有多種促進健康的作用[1]。最近，具有藥理活性的海洋天然產物已顯示具有多種有效的生物學功能，幾乎沒有或沒有毒副作用[2]。因此，它們已成為用於重大疾病的新型先導化合物的最重要資源之一，近年來已得到重要的開發和利用[3]。藻藍蛋白是一種從螺旋藻中提純的海洋天然藍色光合色素蛋白，是全世界公認的天然功能食品之一[4]。藻藍蛋白具有優異的抗腫瘤活性。研究表明，藻藍蛋白在體外對不同癌細胞系具有抗增殖和促凋亡作用，而對正常組織細胞沒有副作用[5,6]。此外，它還顯示出良好的治療價值，如抗氧化劑，抗炎，免疫調節，血管鬆弛和降血脂活性等[7,8,9,10,11]。因此，進一步研究藻藍蛋白的功能和機理具有重要的指導意義和研究價值。
多項研究表明，藻藍蛋白對多種癌症具有生物活性，包括乳腺癌[6,12]，組織細胞性腫瘤[13]，卵巢癌[14]，結腸癌[15]，前列腺癌[16]，黑素瘤和肺癌癌[17]。其中，肺癌是世界上最常見的健康威脅之一，尤其是考慮到其高死亡率[18,19]。人肺癌通常分為兩大類，小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）。 NSCLC佔所有肺癌病例的85％以上，具有較高的死亡率，較低的治愈率和較強的轉移性[20]。因此，探索藻藍蛋白對NSCLC的抗癌作用及其潛在機制至關重要。
藻藍蛋白對NSCLC的抑製作用已在幾項研究中報導。 Li等。揭示藻藍蛋白可以在體內和體外抑制NSCLC A549細胞的生長，並且與全反式維甲酸具有協同的抗腫瘤作用[21,22]。 Bingula等。報導藻藍蛋白和甜菜鹼對A549細胞的活力具有協同抑製作用[23]。 Baudelet等。發現青苔植物矢車菊提取物可以顯著抑制包括A549細胞在內的三種癌細胞系的生長[17]。但是，上述研究都研究了藻藍蛋白在一種NSCLC細胞系中的功能。此外，藻藍蛋白的抗肺癌機制仍不清楚。本文中，我們研究了藻藍蛋白在三種人非小細胞肺癌細胞系NCI-H1299，LTEP-A2和NCI-H460中的生長抑製作用及其潛在機理。研究結果為NSCLC的治療和藻藍蛋白的開發利用奠定了堅實的理論基礎。
結果
藻藍蛋白誘導NSCLC細胞的形態變化
為了解決藻藍蛋白及其對非小細胞肺癌的影響之間的關係，首先研究了不同劑量的藻藍蛋白對NSCLC細胞H1299，H460和LTEP-A2的形態的影響。 如圖1所示，H1299細胞的正常形態是梭形或三角形。 用4.8μM藻藍蛋白處理72小時後，細胞以異常形式出現，其中一些變為針狀。 同樣，藻藍蛋白也異常改變了H460和LTEP-A2細胞的形態。 此外，藻藍蛋白處理後細胞數量明顯減少。 這些結果表明藻藍蛋白可能對NSCLC細胞具有促凋亡作用。
藻藍蛋白誘導NSCLC細胞凋亡
由於藻藍蛋白誘導了NSCLC細胞的形態變化，我們接下來通過Annexin V-FITC和7AAD染色研究了H1299，H460和LTEP-A2細胞的凋亡程度。 圖2顯示，與未處理的細胞相比，藻藍蛋白處理的NSCLC細胞表現出凋亡誘導作用。 與對照組相比，在與2.4 µM藻藍蛋白孵育後，H1299（4.53±0.27％），H460（2.68±0.37％）和LTEP-A2細胞的晚期凋亡百分比增加（4.88±0.55％）。 此外，NSCLC細胞的凋亡程度與藻藍蛋白呈劑量依賴性。 高濃度的藻藍蛋白（4.8 µM）顯著提高了H1299（11.30±0.16％），H460（3.72±0.98％）和LTEP-A2細胞（14.50±0.68％）的晚期凋亡百分比。
為了更深入了解藻藍蛋白誘導的細胞凋亡機制，我們使用定量實時PCR（qRT-PCR）和Western blot檢測了凋亡標誌物的表達。如圖3所示，藻藍蛋白可以顯著增加促凋亡基因Bim，Bak，Bax和Bad的轉錄水平，此外還可以降低H1299和H1299中兩個抗凋亡基因Bcl-xL和Bcl-2的水平。 LTEP-A2細胞系。 Western印跡分析進一步支持了這些結果。有趣的是，在H460細胞中，儘管Bcl-xL的蛋白水平被下調，但在藻藍蛋白處理後其轉錄水平卻增加了。此外，Bcl-2的蛋白質水平沒有顯示出明顯的變化，而其轉錄水平卻明顯下降。這些結果表明轉錄後機制可能涉及H460細胞中這些基因的調節。綜上所述，以上結果提示藻藍蛋白可誘導NSCLC細胞凋亡。
藻藍蛋白對NSCLC細胞顯示出抗轉移（遷移）作用
使用傷口癒合測定法確定藻藍蛋白對細胞遷移的影響。如圖4A所示，藻藍蛋白以劑量和時間依賴性方式顯著抑制H1299，H460和LTEP-A2細胞的遷移（左圖）。計算出遷移率，並顯示在右側面板中。藻藍蛋白（4.8 µM）處理48小時後，H1299細胞的傷口閉合明顯從77.60±0.24％降至37.35±6.24％。在H460和LTEP-A2電池中也發現了類似的結果。值得一提的是，在這項研究中，我們用含有3％而不是10％胎牛血清（FBS）的培養基培養細胞，從而消除了增殖對藻藍蛋白誘導的細胞遷移抑制的作用。基質金屬蛋白酶2（MMP2）和基質金屬蛋白酶9（MMP9）是基質金屬蛋白酶家族的明膠酶，由於它們具有降解細胞外基質蛋白的能力，因此在癌細胞的生長和遷移中起著至關重要的作用[24]。在本研究中，我們發現藻藍蛋白處理可顯著降低NSCLC細胞中MMP2和MMP9的表達（圖4B），這與傷口癒合分析一致。綜上所述，這些結果表明藻藍蛋白對NSCLC細胞遷移表現出抑制活性。
藻藍蛋白抑制NSCLC細胞的增殖和集落形成能力
確定了藻藍蛋白對NSCLC細胞的活力和增殖的抑製作用。如圖5A所示，與對照細胞相比，藻藍蛋白（1.2、2.4和4.8 µM）的孵育劑量依賴性地抑制了三種NSCLC細胞系的生存能力。此外，MTT分析（圖5B）顯示藻藍蛋白（4.8 µM）可以從第二天（H460和LTEP-A2細胞）或第三天（H1299細胞）顯著抑制NSCLC細胞的增殖。這些結果表明藻藍蛋白對受試細胞具有抗增殖作用。為了進一步建立藻藍蛋白對NSCLC細胞轉化特性的抑製作用，我們進行了克隆形成試驗。圖5C顯示了三種類型的NSCLC細胞都可以形成定義明確且不同的集落，只有H1299細胞的集落大於其他兩個細胞系。結果表明，與對照相比，藻藍蛋白處理的細胞顯示出明顯的菌落形成減少，這表明細胞生長和生殖完整性受到了有效抑制。
藻藍蛋白誘導NSCLC細胞的細胞週期阻滯
為了闡明對NSCLC細胞生長的抑制機制，在H1299，H460和LTEP-A2細胞中測定了藻藍蛋白對細胞週期進程的影響。圖6A顯示藻藍蛋白引起H1299和H460細胞的細胞週期分佈的顯著變化。用4.8μM藻藍蛋白孵育後，與對照組相比，H1299和H460中S期細胞的比例分別達到40.10±1.06％和30.60±1.55％（H1299和H460中分別為27.20±0.80％和21.10±0.26％細胞），提示藻藍蛋白在這兩個細胞系中引起S期停滯。有趣的是，與H1299和H460細胞不同，藻藍蛋白（4.8μM）與對照（49.39±0.38％）相比，在LTEP-A2細胞中誘導了G1期的顯著增加（51.79±0.80％）。儘管藻藍蛋白可以抑制NSCLC細胞的增殖，但目前的結果表明LTEP-A2中的抑制機制可能與H1299和H460細胞中的抑制機制不同。為了進一步證實上述結果，我們測試了參與S / G2和G1 / S過渡的細胞週期調控基因的水平。如圖6B所示，藻藍蛋白處理後，S / G2檢查點的兩個關鍵正向調節子Cyclin A和CDK2被顯著下調，而重要的細胞週期抑制基因p21 p21在H1299和H1299中被上調。 H460細胞。然而，在LTEP-A2細胞中，藻藍蛋白抑制了細胞週期蛋白E（一種G1 / S檢查點調節劑）的轉錄水平[27]。 qRT-PCR結果強烈表明藻藍蛋白可以觸發LTEP-A2細胞的G1期停滯以及H1299和H460 NSCLC細胞的S期停滯。
藻藍蛋白降低NSCLC細胞中的NF-κB信號傳導活性
為了研究藻藍蛋白在NSCLC細胞中的潛在調控機制，我們確定了4.8μM藻藍蛋白處理後，H1299，H460和LTEP-A2細胞中NF-κB信號傳導的蛋白表達。 IKKα和IKKβ充當IκBα的催化亞基，IκBα是p65的抑制蛋白。 IKKα/β的磷酸化可能使Ser32處的IκBα蛋白磷酸化，導致泛素介導的蛋白酶體依賴性IκBα降解，隨後是p65磷酸化和NF-κB活化[28]。如圖7所示，儘管IKKα/β，IκBα和p65的總量保持穩定，但它們的磷酸化水平（phospho-IKKα/β-Ser176/ 180，phospho-IκBα-Ser32和phospho-p65-Ser536）是藻藍蛋白處理後顯著降低，表明藻藍蛋白抑制了NF-κB信號傳導的活性。這些結果表明藻藍蛋白可以顯著抑制NSCLC細胞中NF-κB信號傳導的活性。此外，藻藍蛋白還可以減弱H1299，H460和LTEP-A2細胞中AKT的磷酸化水平。
為了進一步探討NF-κB是否與NSCLC細胞的表型因子有關，我們進行了吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC，NK-κB抑製劑）添加實驗。如圖8所示，儘管總p65蛋白量保持穩定，但在10μMPDTC處理後p65的磷酸化水平降低，表明PDTC抑制了H1299，H460和LTEP-A2細胞的NF-κB通路活性。令人驚訝的是，加入PDTC後，CDK2，MMP2和Bcl-xL的蛋白質水平被下調，而Bad的量被上調。這些結果強烈提示NF-κB對NSCLC細胞的表型因子具有調節作用。兩者合計，我們的研究表明藻藍蛋白可通過調節NF-κB途徑抑制遷移和增殖，並促進H1299，H460和LTEP-A2細胞凋亡。儘管確切的機制仍需進一步研究，但本研究闡明了藻藍蛋白在NSCLC細胞中的功能，並提供了有力的證據，有必要進一步探索藻藍蛋白的抗癌機制。
討論
在過去的幾十年中，天然產物在化學預防和治療中的應用已變得非常重要[29,30,31]。越來越多的研究表明，海洋中具有藥理活性的化合物具有強大的生物活性，幾乎沒有副作用[32,33,34]。藻藍蛋白是螺旋藻衍生的一種藻膽蛋白，是對實體惡性腫瘤具有顯著抗癌作用的化合物之一[35,36]。非小細胞肺癌是一種極具侵略性的癌症，幾乎沒有有效的治療選擇，引起了許多研究者的關注。先前的研究表明藻藍蛋白對A549細胞具有抑製作用，A549細胞是一種非小細胞肺癌細胞系[21,22,23]。在這項研究中，我們證明了藻藍蛋白抑制H1299，H460和LTEP-A2 NSCLC細胞系的生長。這些結果與以前的研究一致，表明藻藍蛋白可以抑制多種腫瘤細胞系的增殖[12,13,37]。據我們所知，這是第一個證明藻藍蛋白對這些NSCLC細胞系具有抗癌作用的研究，該研究還強調了藻藍蛋白的細胞毒性和抗轉移作用的可能機制。我們的研究清楚地表明，藻藍蛋白調節著NF-κB信號通路，並且還改變了參與細胞週期和細胞存活的蛋白質表達，從而介導了生長抑制和細胞凋亡。
細胞週期調節在細胞增殖，分化和凋亡中起重要作用。據報導，細胞週期調節功能障礙與腫瘤的發展密切相關[38]。 Peyressatre等。研究發現，細胞週期蛋白依賴性激酶（CDKs）的失活可導致多種人類癌症中細胞增殖的改變[39]。有趣的是，在本研究中，發現藻藍蛋白在H1299和H460細胞系中誘導S期停滯，而在LTEP-A2細胞中引起G1期停滯（圖6），這表明藻藍蛋白在不同的調節機制上存在差異。 NSCLC細胞系。實際上，藻藍蛋白可以通過不同類型的腫瘤中的不同機制充當抗癌化合物。據報導，藻藍蛋白在結腸癌HT-29細胞[7]，乳腺癌MDA-MB-231細胞[6]和慢性粒細胞白血病K562細胞[40]中誘導G1細胞週期停滯。同時，它也可能阻斷胰腺癌PANC-1細胞[41]，卵巢癌SKOV-3細胞[14]和肝癌HepG2細胞[42]中的G2 / M細胞週期進程。 Thangam等。報導藻藍蛋白可以誘導肺腺癌A549細胞的G1期阻滯[7]，這與我們研究中的LTEP-A2細胞的結果一致。值得注意的是，H1299和LTEP-A2均屬於肺腺癌細胞系，但細胞週期受不同階段的限制。有趣的是，姚等。發現假山梨酸B（一種從假山梨根中分離出的二萜酸）可以抑制A549細胞的生長並引起G2 / M阻滯，但對H1299細胞沒有影響，因為H1299是一種p53空細胞系[43]。 因此，我們推測p53可能參與了藻藍蛋白誘導的H1299（p53 null）和LTEP-A2（p53野生型）細胞的細胞週期停滯。但是，其潛在機制仍需要進一步研究。綜上所述，我們的研究提供了關於NSCLC細胞中藻藍蛋白調控方法的有用信息。
在有絲分裂災難激活後停在有絲分裂中的細胞具有不同的命運，包括有絲分裂期間的死亡或進入隨後的細胞週期並隨後死亡的細胞[44]，表明細胞週期調控與凋亡密切相關。在本研究中，發現藻藍蛋白可誘導NSCLC細胞凋亡。藻藍蛋白處理後，H460細胞的凋亡百分比達到3.72±0.98％，與對照細胞明顯不同，但明顯低於H1299（11.3±0.16％）和LTEP-A2細胞（14.5±0.68％）。值得注意的是Shin等。發現（E）-2-亞芐基-3-（環己基氨基）-2,3-二氫-1H-茚滿一酮（BCI，雙重特異性磷酸酶1/6和促分裂原活化的蛋白激酶的抑製劑）顯著抑制與H460細胞相比，H1299細胞的生存力[45]，表明在肺腺癌（H1299和LTEP-A2細胞）和未分化的大細胞肺癌（H460細胞）細胞系中可能存在不同的機制。特別是，兩個凋亡標記（Bcl-2和Bcl-xL）的轉錄和蛋白質水平在H460細胞中表達不一致（圖3），這進一步支持了上述假設。有趣的是，儘管H460細胞的凋亡程度很低，但它顯示了p21的最高表達水平（圖6B）。
已知在某些情況下生長抑制和調節因子的表達可能顯示出差異。 Tsui等。 研究了黃酮類化合物在H460和A549細胞中的抗癌功能，並發現儘管H460細胞比A549對黃酮類化合物更易感，但p53的水平是組成型的，沒有明顯改變[46]。 在本研究中，儘管在藻藍蛋白處理後48小時內H460的細胞凋亡率很低，但在第三天后其增殖率卻急劇下降（圖5B）。 在這種情況下，我們推測，儘管48 h的細胞凋亡率較低，但增加的p21可能會導致細胞生長和活性抑制的延遲。
據報導，NF-κB信號傳導是細胞中的經典途徑之一，可調節多種癌症的增殖和凋亡[47]。最近的研究表明，NF-κB通路與藻藍蛋白誘導的肝癌和胰腺癌細胞的生長抑制有關[41,48]。然而，很少有研究者報導肺癌中NF-κB與藻藍蛋白的關係。只有Bingula等人。發現藻藍蛋白和甜菜鹼的聯合治療可以減少對A549細胞中NF-κB表達的刺激[23]。在本研究中，首次發現藻藍蛋白可降低H1299，H460和LTEP-A2細胞中NF-κB信號的活性（圖7），這表明藻藍蛋白可通過NF-κB的失活抑制增殖並誘導細胞凋亡。 NSCLC細胞系中的κB通路。
癌症轉移是一個複雜的多步驟事件，其中癌細胞離開原發腫瘤的部位並擴散到體內的較遠部位[49]。它是癌症發展過程中最具破壞力的階段，也是與癌症相關的死亡的主要原因[50]。最近，由於藻藍蛋白對癌細胞具有有效的遷移抑製作用，因此引起了廣泛的關注。據報導，藻藍蛋白可通過MAPK信號傳導抑制乳腺癌和黑色素瘤細胞的遷移[6,51]。我們的研究表明，藻藍蛋白首次通過調節MMP2和MMP9對不同的NSCLC細胞發揮了顯著的遷移抑製作用（圖4）。令人驚訝的是，據報導NF-κB在腫瘤遷移中起關鍵作用[52]，並與MMP2具有協同表達模式[53]，這表明MMP2 /NF-κB可能參與藻藍蛋白誘導的NSCLC遷移抑制調節。